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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2019-03-01 - 2023-02-28

Neben den bekannten und gefürchteten Infektionskrankheiten Malaria, Tuberkulose und AIDS gibt es besonders in wirtschaftlich ärmeren Ländern weniger bekannte und trotzdem tödliche Erreger. Bei dem vorliegenden Projekt geht es um den Einzeller Entamoeba histolytica. Geschätzte 50.000 Menschen sterben jedes Jahr an Infektionen mit dieser Amöbe, die besonders den Darm und die Leber des Menschen angreift. Unser Projekt befaßt sich hauptsächlich mit einem komplizierten Oberflächenmolekül, von dem jede einzelne invasive Amöbe etwa 80 Millionen Kopien besitzt. Das Molekül trägt den komplexen Namen Lipopeptidophosphoglykan (LPPG), und zudem weitere Namen. Es besitzt einen Kern aus einem Eiweißmolekül, das mit einer aufwändigen Struktur in der Zellmembran verankert ist. In dem bis heute noch nicht identifizierten Kerneiweiß kommt die Aminosäure Serin häufig vor, an diesen Serinen hängen Phosphatgruppen, die unverzweigte Kohlehydratketten tragen. Wir waren ursprünglich auf das LPPG gestoßen, als wir monoklonale Antikörper aus Mäusen erzeugten, die gegen Oberflächenbestandteile der Amöbe geimpft waren. Ein solcher Antikörper, von uns EH5 genannt, bindet an das LPPG und kann mit Amöben infizierte Mäuse vor Leberabszessen schützen. Später konnten wir zeigen, dass der Antikörper eine bestimmte Aminosäuresequenz im Kerneiweiß von LPPG erkennt, und in den Daten des späteren Genomprojekts entdeckten wir ein Gen, das das Kerneiweiß von LPPG kodieren könnte. Ein Ziel unseres Projekts ist der Nachweis, ob genau dieses Genprodukt oder ein anderes wirklich den Kern des LPPG bildet. Ein weiterer Teil des Projekts soll untersuchen, wie die Seitenketten des LPPG gebildet werden. Sie bestehen aus Glukose, dem häufigsten Zuckermolekül, das jedoch in einer ungewöhnlichen Weise, wie bei der Oberfläche von Kariesbakterien, verbunden ist. Eine weitere Frage ist, wie die Amöbe die Basis dieser Ketten herstellt. Bei der Struktur des LPPG Moleküls fällt auch auf, dass Galaktose an verschiedenen Stellen eingebaut ist. Galaktose unterscheidet sich von Glukose nur dadurch, dass eine einzige Gruppe in eine andere Richtung weist. Das Enzym GalE mit dem Namen UDP-Glukose 4´-Epimerase kann UDP-Glukose in UDP-Galaktose umwandeln und damit die aktivierte Form von Galaktose erzeugen. Wir planen, das Gen für GalE in den Amöben abzuschalten, um zu untersuchen, welche Auswirkungen das auf das LPPG und generell auf die Amöben hat. Weiters suchen wir nach den Transferasen, die speziell den Zucker Galaktose einbauen können. Bei der Suche nach Enzymen für die Kohlehydratbiosynthese haben wir bereits alle Datenbanken durchforstet und eine Ausgangsliste erstellt. Eine tiefere Analyse zusammen mit einem Kollegen in Frankreich ist geplant. Insgesamt erwarten wir, dass wir in der Wiener Zusammenarbeit von der molekularen Parasitologie an der Medizinischen Universität mit der Kohlehydratbiochemie an der Universität für Bodenkultur einen signifikanten Beitrag zum Verständnis der Oberfläche von pathogenen Entamoeben liefern wird.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2018-01-01 - 2020-12-31

Die Belastung von Trinkwasser, Grundwasser und Böden durch Chlorit (ClO2-) wird zu einem immer größer werdenden Umweltproblem, da Chlorit wegen seiner oxidativen Eigenschaften für lebende Zellen toxisch ist. Interessanterweise können viele Bakterienarten aber Chlorit mit Hilfe eines Enzyms namens Chloritdismutase in harmloses Chlorid (Cl-) und Sauerstoff (O2) abbauen. Dabei wird eine O-O Bindung gebildet, eine Reaktion wie sie bisher nur in phototrophen und sauerstofffreisetzenden Organismen (z.B. Pflanzen) beobachtet werden konnte. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften könnte Chloritdismutase in Zukunft beim Abbau von Chlorit in Trinkwasser oder als Generator von O2 in verschiedensten biotechnologischen Anwendungen eingesetzt werden. Dazu ist es aber nötig, die Struktur-Funktionsbeziehungen in diesem biologischen Katalysator besser zu verstehen. Ziel dieses Projektes ist es daher, den genauen Mechanismus des Chloritabbaus durch Chloritdismutase herauszufinden. Es ist bereits gelungen, das Enzym funktional in großen Mengen rekombinant herzustellen und dessen dreidimensionale Struktur in atomarer Auflösung aufzuklären. Dies ist nun eine ausgezeichnete Voraussetzung, die molekularen Teilschritte und Enzymintermediate, die Chloritdismutase beim Abbau des Substrats durchläuft, zu eruieren. Hier ist festzuhalten, dass dazu widersprüchliche Hypothesen in der Fachliteratur kursieren und unklar ist, ob z.B. Chlormonoxid oder Hypochlorit als Zwischenprodukt entsteht, oder warum und wie das Enzym bei höheren pH-Werten inaktiviert wird. Ein Projekt im Forschungsbereich der molekularen Katalyse benötigt die umfassende Anwendung vieler biochemischer und biophysikalischer Methoden: (i) rekombinante Produktion des Wild-Typ Enzyms und von Einzelmutanten; (ii) die Charakterisierung dieser Eisenproteine mit verschiedensten spektroskopischen und electrochemischen Methoden, um die Struktur und Reaktivität des aktiven Zentrums besser zu verstehen; (iii) Analyse der individuellen Reaktionsschritte und Charakterisierung der elektronischen Struktur der Redoxintermediate, die für die Katalyse relevant sind, z.B. durch Stopped-flow Spektroskopie; und (iv) die Aufklärung der Röntgen- und Neutronen-Kristallstrukturen. Diese Arbeiten werden in enger Zusammenarbeit mit international anerkannten Spezialisten aus Österreich, Italien, Belgien und USA durchgeführt. Das erworbene Wissen über Struktur und Funktion von Chloritdismutase wird die Basis liefern sowohl zum Verständnis der physiologischen Rolle dieser Enzyme in Bakterien als auch zu möglichen biotechnologischen Anwendungen wie z.B. der Dekontamination von verseuchtem Trinkwasser.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-07-01 - 2021-06-30

Biosynthese von Wurm N-Glykoproteinen in Insektenzellen: Haemonchus contortus ist einer der bedeutendsten parasitären Würmer, der Schafe und Ziegen befällt und dadurch wirtschaftliche Verluste im Wiederkäuersektor verursacht und folglich die Lebensmittelsicherheit bedroht. Im Vergleich zur Verwendung von Anthelminthika, die eine Resistenz gegen parasitäre Nematoden verursachen können, stellt die Impfung einen nachhaltigen und wirksamen Ansatz dar. Die Impfung mit einer Mischung aus nativen Haemonchus-Glykoproteinen (H11-Antigene) zeigte einen wirksamen Schutz bei Lämmern. Versuche, diese Antigene rekombinant in unterschiedlichen Expressionswirten zu züchten und sie als Impfstoffe zu verwenden, zeigten entweder einen geringen oder gar keinen Schutz bei Tierversuchen. Da bekannt ist, dass native H11-Antigene auf der Oberfläche zusätzliche Zucker-Modifizierungen tragen (als „Glykosylierung“ bezeichnet), was bei der biologischen Funktion von Antigenen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Erforschung einer Möglichkeit zur Nachahmung dieser natürlichen Zucker-Modifizierungen für die Produktion von wirksamen Antigenen erforderlich. Die Zuckerstrukturen der nativen H11-Antigenen besitzen bis zu drei Fukosereste, die durch drei Fukosyltransferasen synthetisiert werden. Eine gewöhnliche Insektenzellenlinie (Hi5) ist der ideale Wirt für Glycoengineering, um wirksame rekombinante Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, zu produzieren. Die Infektion von Wirtszellen mit rekombinanten Baculovirus, der Glykoenzyme von Caenorhabditis elegans codiert, wird verwendet um die Zucker auf den Wurmantigenen wirksam umzubilden. Die biologische Rolle der C. elegans Glykoenzyme wird durch die Erforschung der Zuckerstrukturen von speziellen Mutanten mittels HPLC und Massenspektrometer erforscht. Rekombinanter Baculovirus mit zwei C. elegans Glykoenzymen und DNA-Sequenzen von Haemonchus H11 (Reporterproteine) wird zur Produktion von H11-Antigenen in Hi5-Insektenzellen herangezogen. Zusätzlich zu den Protein-Sequenzen und Peptidaseaktivitäten werden die biochemischen Eigenschaften der glycoengineerten H11-Antigenen mit Hauptaugenmerk auf die Zuckermodifikationen und andere potentielle Proteinmodifikationen beurteilt. Dies ist möglicherweise der erste Versuch in Insektenzellen Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, herzustellen. Es wird erwartet, dass die glycoengineerten H11-Antigene die nativen H11-Antigene besser nachahmen und sich daher besser als Veterinärimpfstoff zum Schutz von Wiederkäuern vor einer Haemonchus-Infektion eignen.

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