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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-07-01 - 2018-02-28

Markierungsexperimente mit stabilen Isotopen, v.a. 13C, in Form der metabolischen Flussanalyse sind, neben der Quantifizierung von Metabolitenkonzentrationen, ein wichtiger Ansatz um Veränderungen im zellulären Metabolismus besser verstehen zu können. Die stabilen im Substrat eingebauten Isotopen führen zu charakteristischen Isotopenmustern in den einzelnen Stoffwechselprodukten. Nach der chromatographischen Auftrennung der Zielanalyten, welche in eine komplexe biologische Matrix eingebettet sind, können die Isotopenmuster über massenspektrometrische (MS) Detektion gemessen werden. Trotz eines gewissen Mehraufwands hinsichtlich der notwendigen Derivatisierung, ist die gaschromatographische (GC) Trennung bestimmter Metabolite, wie beispielsweise der unterschiedlichen Isomere des Pentose-Phosphatweges, nach wie vor die Methode der Wahl. Hinzu kommt, dass aufgrund der Derivatisierung ein weites Spektrum an Metaboliten unterschiedlicher Polarität der GC/MS Analyse zugänglich gemacht wird. Allerdings wird die Bestimmung der charakteristischen Isotopenmuster dadurch erschwert, dass es bei den typischerweise aufgenommenen Elektronenstoßionisierungsspektren (EI) bei 70 eV zu einer starken Fragmentierung des Moleküls kommt und somit nur beschränkte Information zum intakten Kohlenstoffgerüst der jeweiligen Metaboliten verfügbar ist. Das macht den Einsatz komplizierter bioinformatischer Algorithmen für die Zusammenführung von Markierungsdaten unterschiedlicher Kohlenstoffgerüstfragmente notwendig. Um diesem Problem gerecht zu werden, kommt im vorliegenden Projekt eine neue „niedrig-Energie EI“-Quelle der Firma Agilent Technologies Inc. zum Einsatz. Verglichen mit den konventionellen Ionisierungsquellen, bleibt das intakte Molekülion zu einem höheren Ausmaß erhalten, während gleichzeitig die typischen Fragmente beobachtet werden können. Diese analytische Plattform erlaubt in Kombination mit einem hochauflösenden Flugzeitmassenspektrometer mit hoher Massengenauigkeit die selektive Bestimmung der Isotopenmuster. Ziel dieses Kooperationsprojektes mit der Firma Agilent Technologies ist die Etablierung einer GC/MS Analysestrategie für die Bestimmung von Isotopenmustern und, bei ausgewählten Metaboliten, der Position der stabilen Isotopen im Kohlenstoffgerüst einzelner Metabolite.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-07-01 - 2021-06-30

Biosynthese von Wurm N-Glykoproteinen in Insektenzellen: Haemonchus contortus ist einer der bedeutendsten parasitären Würmer, der Schafe und Ziegen befällt und dadurch wirtschaftliche Verluste im Wiederkäuersektor verursacht und folglich die Lebensmittelsicherheit bedroht. Im Vergleich zur Verwendung von Anthelminthika, die eine Resistenz gegen parasitäre Nematoden verursachen können, stellt die Impfung einen nachhaltigen und wirksamen Ansatz dar. Die Impfung mit einer Mischung aus nativen Haemonchus-Glykoproteinen (H11-Antigene) zeigte einen wirksamen Schutz bei Lämmern. Versuche, diese Antigene rekombinant in unterschiedlichen Expressionswirten zu züchten und sie als Impfstoffe zu verwenden, zeigten entweder einen geringen oder gar keinen Schutz bei Tierversuchen. Da bekannt ist, dass native H11-Antigene auf der Oberfläche zusätzliche Zucker-Modifizierungen tragen (als „Glykosylierung“ bezeichnet), was bei der biologischen Funktion von Antigenen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Erforschung einer Möglichkeit zur Nachahmung dieser natürlichen Zucker-Modifizierungen für die Produktion von wirksamen Antigenen erforderlich. Die Zuckerstrukturen der nativen H11-Antigenen besitzen bis zu drei Fukosereste, die durch drei Fukosyltransferasen synthetisiert werden. Eine gewöhnliche Insektenzellenlinie (Hi5) ist der ideale Wirt für Glycoengineering, um wirksame rekombinante Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, zu produzieren. Die Infektion von Wirtszellen mit rekombinanten Baculovirus, der Glykoenzyme von Caenorhabditis elegans codiert, wird verwendet um die Zucker auf den Wurmantigenen wirksam umzubilden. Die biologische Rolle der C. elegans Glykoenzyme wird durch die Erforschung der Zuckerstrukturen von speziellen Mutanten mittels HPLC und Massenspektrometer erforscht. Rekombinanter Baculovirus mit zwei C. elegans Glykoenzymen und DNA-Sequenzen von Haemonchus H11 (Reporterproteine) wird zur Produktion von H11-Antigenen in Hi5-Insektenzellen herangezogen. Zusätzlich zu den Protein-Sequenzen und Peptidaseaktivitäten werden die biochemischen Eigenschaften der glycoengineerten H11-Antigenen mit Hauptaugenmerk auf die Zuckermodifikationen und andere potentielle Proteinmodifikationen beurteilt. Dies ist möglicherweise der erste Versuch in Insektenzellen Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, herzustellen. Es wird erwartet, dass die glycoengineerten H11-Antigene die nativen H11-Antigene besser nachahmen und sich daher besser als Veterinärimpfstoff zum Schutz von Wiederkäuern vor einer Haemonchus-Infektion eignen.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2016-06-01 - 2019-05-31

Die Erkennung von Krankheitserregern, insbesondere Bakterien, durch das Immunsystem von Säugern ist Gegenstand weltweiter intensiver Forschung. Die Aufgabe der angeborenen Immunität besteht darin, eine Infektion während der ersten Tage, die bis zum Einsetzen der erworbenen Immunität vergehen, unter Kontrolle zu halten. Die Proteine des angeborenen Immunsystems sind für die Bekämpfung bakterieller Infektionen von entscheidender Bedeutung. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Hauptbestandteil der komplexen äußeren Wandschicht Gram-negativer Bakterien. Die proximale Region des bakteriellen Lipopolysaccharids, das Glykophospholipid Lipid A, wird von dem Transmembranprotein Toll-ähnlichen Rezeptor 4 (TLR4) und dem intrazellularem Enzym Caspase-4/11 erkannt, die zu den Rezeptoren des angeborenen Immunsystems in Säugern zählen. Erkennung von LPS durch TLR4 und Caspase-4/11 führt in erster Linie zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems vom Wirtsorganismus und zur Beseitigung Gram-negativer Infektionen, kann aber bei schweren Erkrankungen lebensbedrohliche Symptomkomplexe wie Sepsis hervorrufen. Aktivierung von TLR4 ist auch an der Entstehung chronischer Entzündings-, Autoimmun- und Infektionskrankheiten beteiligt. Anderseits wird die Stimulierung von TLR4 mit Substanzen geringerer Toxität zur Impfstoffadjuvantentwicklung eingesetzt. Auf molekularer Ebene erfolgt die Aktivierung des TLR4 durch das Binden von Lipid A an der Bindungstasche von TLR4-Korezeptor Protein Myeloid Differentiation Factor (MD-2), was zur Dimerisierung von zwei TLR4/MD-2/LPS Einheiten in der Zellmembrane führt. Verschiedene Bakterienarten, die sich in der Zusammensetzung des Lipid´s A unterscheiden, können verschiedenen Grad an Dimerisierung des Rezeptorkomplexes hervorrufen. Das Bilden von TLR4/MD-2/LPS Dimeren löst eine entzündliche Reaktion aus und verursacht daher unterschiedlich starke Immunantworten. Bisher wurde ausschließlich die chemische Struktur des Lipids A für die Stärke der entzündlichen Reaktion verantwortlich gemacht. Im Mittelpunkt des Projektes steht die Entwicklung neuer Lipid A Mimetika, in welcher das flexible und mit drei Bindungen verknüpfte Glucosamin Disaccharid des Lipid A durch ein steifes und mit zwei Bindungen verknüpftes Disaccharid ersetzt ist. Die Sekundär-Konformation von Lipid A Mimetika sollte dabei die entscheidende Rolle in der Aktivierung des TLR4 Komplexes und Caspase-4/11 spielen. Mithilfe gezielter chemischer Modifikationen an synthetischen Lipid A Mimetika wird versucht, molekulare Grundlagen der Erkennung von Lipopolysaccharid durch TLR4 und Caspase-4 herauszufinden. Die Ergebnisse sind von enormer Bedeutung für die Entwicklung neuer Immuno-Therapeutika für die Bekämpfung der Autoimmun- und Entzündlichen Erkrankungen sowie für die Erforschung der effizienten Strategien zu Herstellung neuer Impfstoffadjuvanten.

Betreute Hochschulschriften