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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2016-06-01 - 2019-05-31

Die Erkennung von Krankheitserregern, insbesondere Bakterien, durch das Immunsystem von Säugern ist Gegenstand weltweiter intensiver Forschung. Die Aufgabe der angeborenen Immunität besteht darin, eine Infektion während der ersten Tage, die bis zum Einsetzen der erworbenen Immunität vergehen, unter Kontrolle zu halten. Die Proteine des angeborenen Immunsystems sind für die Bekämpfung bakterieller Infektionen von entscheidender Bedeutung. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Hauptbestandteil der komplexen äußeren Wandschicht Gram-negativer Bakterien. Die proximale Region des bakteriellen Lipopolysaccharids, das Glykophospholipid Lipid A, wird von dem Transmembranprotein Toll-ähnlichen Rezeptor 4 (TLR4) und dem intrazellularem Enzym Caspase-4/11 erkannt, die zu den Rezeptoren des angeborenen Immunsystems in Säugern zählen. Erkennung von LPS durch TLR4 und Caspase-4/11 führt in erster Linie zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems vom Wirtsorganismus und zur Beseitigung Gram-negativer Infektionen, kann aber bei schweren Erkrankungen lebensbedrohliche Symptomkomplexe wie Sepsis hervorrufen. Aktivierung von TLR4 ist auch an der Entstehung chronischer Entzündings-, Autoimmun- und Infektionskrankheiten beteiligt. Anderseits wird die Stimulierung von TLR4 mit Substanzen geringerer Toxität zur Impfstoffadjuvantentwicklung eingesetzt. Auf molekularer Ebene erfolgt die Aktivierung des TLR4 durch das Binden von Lipid A an der Bindungstasche von TLR4-Korezeptor Protein Myeloid Differentiation Factor (MD-2), was zur Dimerisierung von zwei TLR4/MD-2/LPS Einheiten in der Zellmembrane führt. Verschiedene Bakterienarten, die sich in der Zusammensetzung des Lipid´s A unterscheiden, können verschiedenen Grad an Dimerisierung des Rezeptorkomplexes hervorrufen. Das Bilden von TLR4/MD-2/LPS Dimeren löst eine entzündliche Reaktion aus und verursacht daher unterschiedlich starke Immunantworten. Bisher wurde ausschließlich die chemische Struktur des Lipids A für die Stärke der entzündlichen Reaktion verantwortlich gemacht. Im Mittelpunkt des Projektes steht die Entwicklung neuer Lipid A Mimetika, in welcher das flexible und mit drei Bindungen verknüpfte Glucosamin Disaccharid des Lipid A durch ein steifes und mit zwei Bindungen verknüpftes Disaccharid ersetzt ist. Die Sekundär-Konformation von Lipid A Mimetika sollte dabei die entscheidende Rolle in der Aktivierung des TLR4 Komplexes und Caspase-4/11 spielen. Mithilfe gezielter chemischer Modifikationen an synthetischen Lipid A Mimetika wird versucht, molekulare Grundlagen der Erkennung von Lipopolysaccharid durch TLR4 und Caspase-4 herauszufinden. Die Ergebnisse sind von enormer Bedeutung für die Entwicklung neuer Immuno-Therapeutika für die Bekämpfung der Autoimmun- und Entzündlichen Erkrankungen sowie für die Erforschung der effizienten Strategien zu Herstellung neuer Impfstoffadjuvanten.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2016-03-01 - 2019-02-28

Viele Gram-negative Bakterien verfügen über effiziente Abwehrmechanismen gegenüber dem Immunsystem der jeweiligen Wirtsorganismen. Grundlegende Funktionen übt in diesem Zusammenhang die äußere Membran der bakteriellen Zellwand aus, die zahlreiche negativ geladene Substituenten in Form von Säure- bzw. Phosphathältigen Kohlenhydratstrukturen aufweist. Diese Barrierewirkung der bakteriellen Zellmembran wird jedoch insbesondere durch entgegengesetzt (positiv) geladene Eiweißverbindungen (Peptide) des angeborenen Immunsystems überwunden, wogegen sich viele Bakterien wiederum durch Einbau positiv geladener Aminozucker wie Aminoarabinose schützen und somit resistent werden. Von besonderer Bedeutung sind diese Membranmodifikationen in den pflanzenpathogenen Burkholderien, die landwirtschaftlich genutzt werden, aber in den letzten Jahren zunehmend Bedeutung als Humanpathogene erlangt haben. Die Besiedlung der Lunge mit Burkholderia cepacia führt zum drastischen Verfall der Lungenfunktion und in Form des „Cepacia-Syndroms“ zu einem letalen Verlauf der Infektion. Die Multiresistenz vieler klinischer Isolate gegen die meisten gängigen Antibiotika ist eine weitere Besonderheit von Burkholderien. Die Enzyme, welche die Aminoarabinose auf das bakterielle Lipopolysaccharid übertragen sind noch sehr unvollständig charakterisiert, ebenso die an der Biosynthese beteiligten Enzyme die in mehreren Schritten die Aktivierung der Aminoarabinose in Form langkettiger Zuckerphosphat-Lipide als Substrat bewirken. Nachdem diese Verbindungen nur in sehr geringen Mengen aus natürlichen Quellen isolierbar sind, sollen durch chemische Synthese die nativen Substrate und eine Reihe von Fluoreszenz-markierten Derivaten hergestellt werden. Mit den Syntheseprodukten sollte auch zu klären sein, ob ein oder zwei unterschiedliche Enzyme die Aminoarabinose übertragen. Die zentralen Syntheseschritte sollen zunächst an kürzeren, einfachen Lipiden etabliert und in der Folge auf die komplexen lang-kettigen Lipide (Heptaprenol und Undekaprenol mit 35 bzw. 55 Kohlenstoffatomen) übertragen werden. Darüber hinaus sind auch Kohlenstoffverknüpfte Derivate (C-Phosphonate und monofluorierte C-Phosphonate) geplant, die den Aminoarabinose-Transfer blockieren sollen und damit die Wirksamkeit der antimikrobiellen Peptide wiederherstellen könnten. In Kooperation mit Miguel Valvano (Queens University Belfast, UK), der über langjährige Forschungserfahrung in der Mikrobiologie und Genetik von Burkholderien verfügt, sollen die in Wien synthetisierten Verbindungen getestet werden. Geeignete Inhibitoren und Substrate sollen in der Folge in Bindungsstudien (Kernresonanzspektroskopie, Röntgenkristallographie) eingesetzt werden. Insgesamt ist ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der Übertragung von Phospholipid-Zuckern auf die bakteriellen Akzeptorsubstrate mit weitreichenden Implikationen in der künftigen Therapie von multiresistenten Burkholderien und anderen Gram-negativen Pathogenen zu erwarten.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2014-08-01 - 2018-03-31

Trotz der Fortschritte in der Entwicklung antiviraler Wirkstoffe stellt die Bekämpfung der weltweiten Pandemie - hervorgerufen durch das humane Immunodeficieny Virus (HIV-1) - eine große Herausforderung dar. Die Entwicklung von breit-schützenden und neutralisierenden Antikörpern wird vor allem durch die viralen Gegenstrategien im Immungeschehen erschwert. Die dicht gepackte Anordnung von Mannose-Ketten im Glykoprotein gp120 auf den viralen Hüllproteinen kann dennoch als „Achillesferse“ für die Erkennung durch Antikörper genutzt werden. Eine überschaubare Anzahl von Antikörpern gegen gp120 wurde inzwischen entwickelt, die sehr spezifische Bindungsbereiche erkennen. Die große strukturelle Ähnlichkeit der Mannose-Glykane mit humanen Glykoprotein-Glykanen führt jedoch zu einer niedrigen Immunogenität und einer geringen Bindungsaffinität der viralen Kohlenhydratepitope. Vor kurzem wurde ein dem gp120 verwandtes Glykan in der Kernregion des bakteriellen Lipopolysaccharids des Gram-negativen Bodenbakteriums Rhizobium radiobacter gefunden. In ersten Testexperimenten konnte gezeigt werden, dass diese Glykane mit niedriger Affinität an HIV-Antikörper gebunden werden. Strukturdaten eines gp120 Liganden und dem bakteriellen Glykan im Komplex mit zwei monoklonalen anti-HIV Antikörpern zeigten jedoch das Potential für zusätzliche Bindungsinteraktionen mit den bakteriellen Mannoseketten auf. Darüber hinaus sollten die bakterien-spezifischen Kohlenhydrate als körperfremde Antigene zu einer verstärkten Immunantwort und einer verminderten Autoreaktivität führen. Zwei Hypothesen sollen im Rahmen des Projekts geklärt werden: Können neue modifizierte bakterielle HIV-ähnliche Glykane die viralen gp120 Epitope nachbilden und werden diese Glykane besser von monoklonalen anti-HIV Antikörpern gebunden sowie zur Erzeugung neutralisierender Antikörper genutzt werden? Das Projekt beinhaltet somit die chemische Synthese dieser Oligosaccharide bis zur Größe von Undekasacchariden als modifizierte und Ketten-verlängerte gp120 Mimetika basierend auf der Kombination der strukturell konservierten bakteriellen Lipopolysaccharid-Komponente mit zwei viralen Oligomannose-Ketten. Als Kontroll-Glykane werden die Mannose-Glykane auch ohne den bakteriellen Kohlenhydrat-Anteil hergestellt werden. Die Liganden werden mit funktionellen Spacergruppen ausgestattet um diese mit Biotin sowie kovalent mit Proteinen zu verknüpfen und nachfolgend die Bindung an HIV-spezifische monoklonale Antikörper zu testen. Darüber hinaus werden die Liganden in große Clustermoleküle überführt, um auf Grund der multiplen Präsentation der Epitope eine wesentlich gesteigerte Bindungsaffinität zu gewährleisten. NMR Studien sind geplant, die detaillierten Einblick in die Wechselwirkung der HIV-Antikörper mit den Liganden ermöglichen sollten. Immunchemische Studien erfolgen gemeinsam mit Dr. Kunert am Department für Biotechnologie (BOKU) und mit Dr. Pantophlet der Simon Fraser Universität in Kanada. Sollten die Bindungsstudien erfolgreich verlaufen, können künftig Immunisierungen mit den Neoglykokonjugaten erfolgen um damit gegebenenfalls breit kreuz-reagierende und neutralisierende Antikörper zu erzeugen. Das Projekt sollte daher substanziell zu neuen Zugängen in der anti-HIV Impfstoffentwicklung beitragen, und /oder zu Kombinationstherapien beitragen und einen erheblichen Impakt auf die Strategie des Anti-AIDS Immunogen-Designs erzielen.

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