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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2018-01-01 - 2020-12-31

Die Belastung von Trinkwasser, Grundwasser und Böden durch Chlorit (ClO2-) wird zu einem immer größer werdenden Umweltproblem, da Chlorit wegen seiner oxidativen Eigenschaften für lebende Zellen toxisch ist. Interessanterweise können viele Bakterienarten aber Chlorit mit Hilfe eines Enzyms namens Chloritdismutase in harmloses Chlorid (Cl-) und Sauerstoff (O2) abbauen. Dabei wird eine O-O Bindung gebildet, eine Reaktion wie sie bisher nur in phototrophen und sauerstofffreisetzenden Organismen (z.B. Pflanzen) beobachtet werden konnte. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften könnte Chloritdismutase in Zukunft beim Abbau von Chlorit in Trinkwasser oder als Generator von O2 in verschiedensten biotechnologischen Anwendungen eingesetzt werden. Dazu ist es aber nötig, die Struktur-Funktionsbeziehungen in diesem biologischen Katalysator besser zu verstehen. Ziel dieses Projektes ist es daher, den genauen Mechanismus des Chloritabbaus durch Chloritdismutase herauszufinden. Es ist bereits gelungen, das Enzym funktional in großen Mengen rekombinant herzustellen und dessen dreidimensionale Struktur in atomarer Auflösung aufzuklären. Dies ist nun eine ausgezeichnete Voraussetzung, die molekularen Teilschritte und Enzymintermediate, die Chloritdismutase beim Abbau des Substrats durchläuft, zu eruieren. Hier ist festzuhalten, dass dazu widersprüchliche Hypothesen in der Fachliteratur kursieren und unklar ist, ob z.B. Chlormonoxid oder Hypochlorit als Zwischenprodukt entsteht, oder warum und wie das Enzym bei höheren pH-Werten inaktiviert wird. Ein Projekt im Forschungsbereich der molekularen Katalyse benötigt die umfassende Anwendung vieler biochemischer und biophysikalischer Methoden: (i) rekombinante Produktion des Wild-Typ Enzyms und von Einzelmutanten; (ii) die Charakterisierung dieser Eisenproteine mit verschiedensten spektroskopischen und electrochemischen Methoden, um die Struktur und Reaktivität des aktiven Zentrums besser zu verstehen; (iii) Analyse der individuellen Reaktionsschritte und Charakterisierung der elektronischen Struktur der Redoxintermediate, die für die Katalyse relevant sind, z.B. durch Stopped-flow Spektroskopie; und (iv) die Aufklärung der Röntgen- und Neutronen-Kristallstrukturen. Diese Arbeiten werden in enger Zusammenarbeit mit international anerkannten Spezialisten aus Österreich, Italien, Belgien und USA durchgeführt. Das erworbene Wissen über Struktur und Funktion von Chloritdismutase wird die Basis liefern sowohl zum Verständnis der physiologischen Rolle dieser Enzyme in Bakterien als auch zu möglichen biotechnologischen Anwendungen wie z.B. der Dekontamination von verseuchtem Trinkwasser.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-07-01 - 2021-06-30

Biosynthese von Wurm N-Glykoproteinen in Insektenzellen: Haemonchus contortus ist einer der bedeutendsten parasitären Würmer, der Schafe und Ziegen befällt und dadurch wirtschaftliche Verluste im Wiederkäuersektor verursacht und folglich die Lebensmittelsicherheit bedroht. Im Vergleich zur Verwendung von Anthelminthika, die eine Resistenz gegen parasitäre Nematoden verursachen können, stellt die Impfung einen nachhaltigen und wirksamen Ansatz dar. Die Impfung mit einer Mischung aus nativen Haemonchus-Glykoproteinen (H11-Antigene) zeigte einen wirksamen Schutz bei Lämmern. Versuche, diese Antigene rekombinant in unterschiedlichen Expressionswirten zu züchten und sie als Impfstoffe zu verwenden, zeigten entweder einen geringen oder gar keinen Schutz bei Tierversuchen. Da bekannt ist, dass native H11-Antigene auf der Oberfläche zusätzliche Zucker-Modifizierungen tragen (als „Glykosylierung“ bezeichnet), was bei der biologischen Funktion von Antigenen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Erforschung einer Möglichkeit zur Nachahmung dieser natürlichen Zucker-Modifizierungen für die Produktion von wirksamen Antigenen erforderlich. Die Zuckerstrukturen der nativen H11-Antigenen besitzen bis zu drei Fukosereste, die durch drei Fukosyltransferasen synthetisiert werden. Eine gewöhnliche Insektenzellenlinie (Hi5) ist der ideale Wirt für Glycoengineering, um wirksame rekombinante Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, zu produzieren. Die Infektion von Wirtszellen mit rekombinanten Baculovirus, der Glykoenzyme von Caenorhabditis elegans codiert, wird verwendet um die Zucker auf den Wurmantigenen wirksam umzubilden. Die biologische Rolle der C. elegans Glykoenzyme wird durch die Erforschung der Zuckerstrukturen von speziellen Mutanten mittels HPLC und Massenspektrometer erforscht. Rekombinanter Baculovirus mit zwei C. elegans Glykoenzymen und DNA-Sequenzen von Haemonchus H11 (Reporterproteine) wird zur Produktion von H11-Antigenen in Hi5-Insektenzellen herangezogen. Zusätzlich zu den Protein-Sequenzen und Peptidaseaktivitäten werden die biochemischen Eigenschaften der glycoengineerten H11-Antigenen mit Hauptaugenmerk auf die Zuckermodifikationen und andere potentielle Proteinmodifikationen beurteilt. Dies ist möglicherweise der erste Versuch in Insektenzellen Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, herzustellen. Es wird erwartet, dass die glycoengineerten H11-Antigene die nativen H11-Antigene besser nachahmen und sich daher besser als Veterinärimpfstoff zum Schutz von Wiederkäuern vor einer Haemonchus-Infektion eignen.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-03-01 - 2020-02-29

Certain prolyl residues of proteins are converted to 4-hydroxyproline. The responsible prolyl-hydroxylases in plants recognize different patterns than their mammalian relatives. In plants, hydroxyproline residues are the anchor points for the attachment of arabinosyl oligomers and of arabinogalactan polymers. While the physiological functions of all these modifications are largely unknown, they certainly pose a problem for the use of plants as production hosts of pharmaceutical proteins. Our recent work revealed that sites of mucin-type O-glycosylation as they occur in EPO or IgA 1 are particularily affected by Pro-hydroxylation. Plants, e.g. N. benthamiana, contain a multitude of prolyl hydroxylase homologs (paralogs). Based on research with Arabidopsis thaliana and the moss Physcomitrella patens only one or a few of them may be responsible for modification of a particular protein.

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