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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-07-01 - 2021-06-30

Biosynthese von Wurm N-Glykoproteinen in Insektenzellen: Haemonchus contortus ist einer der bedeutendsten parasitären Würmer, der Schafe und Ziegen befällt und dadurch wirtschaftliche Verluste im Wiederkäuersektor verursacht und folglich die Lebensmittelsicherheit bedroht. Im Vergleich zur Verwendung von Anthelminthika, die eine Resistenz gegen parasitäre Nematoden verursachen können, stellt die Impfung einen nachhaltigen und wirksamen Ansatz dar. Die Impfung mit einer Mischung aus nativen Haemonchus-Glykoproteinen (H11-Antigene) zeigte einen wirksamen Schutz bei Lämmern. Versuche, diese Antigene rekombinant in unterschiedlichen Expressionswirten zu züchten und sie als Impfstoffe zu verwenden, zeigten entweder einen geringen oder gar keinen Schutz bei Tierversuchen. Da bekannt ist, dass native H11-Antigene auf der Oberfläche zusätzliche Zucker-Modifizierungen tragen (als „Glykosylierung“ bezeichnet), was bei der biologischen Funktion von Antigenen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Erforschung einer Möglichkeit zur Nachahmung dieser natürlichen Zucker-Modifizierungen für die Produktion von wirksamen Antigenen erforderlich. Die Zuckerstrukturen der nativen H11-Antigenen besitzen bis zu drei Fukosereste, die durch drei Fukosyltransferasen synthetisiert werden. Eine gewöhnliche Insektenzellenlinie (Hi5) ist der ideale Wirt für Glycoengineering, um wirksame rekombinante Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, zu produzieren. Die Infektion von Wirtszellen mit rekombinanten Baculovirus, der Glykoenzyme von Caenorhabditis elegans codiert, wird verwendet um die Zucker auf den Wurmantigenen wirksam umzubilden. Die biologische Rolle der C. elegans Glykoenzyme wird durch die Erforschung der Zuckerstrukturen von speziellen Mutanten mittels HPLC und Massenspektrometer erforscht. Rekombinanter Baculovirus mit zwei C. elegans Glykoenzymen und DNA-Sequenzen von Haemonchus H11 (Reporterproteine) wird zur Produktion von H11-Antigenen in Hi5-Insektenzellen herangezogen. Zusätzlich zu den Protein-Sequenzen und Peptidaseaktivitäten werden die biochemischen Eigenschaften der glycoengineerten H11-Antigenen mit Hauptaugenmerk auf die Zuckermodifikationen und andere potentielle Proteinmodifikationen beurteilt. Dies ist möglicherweise der erste Versuch in Insektenzellen Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, herzustellen. Es wird erwartet, dass die glycoengineerten H11-Antigene die nativen H11-Antigene besser nachahmen und sich daher besser als Veterinärimpfstoff zum Schutz von Wiederkäuern vor einer Haemonchus-Infektion eignen.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2017-03-01 - 2020-02-29

Certain prolyl residues of proteins are converted to 4-hydroxyproline. The responsible prolyl-hydroxylases in plants recognize different patterns than their mammalian relatives. In plants, hydroxyproline residues are the anchor points for the attachment of arabinosyl oligomers and of arabinogalactan polymers. While the physiological functions of all these modifications are largely unknown, they certainly pose a problem for the use of plants as production hosts of pharmaceutical proteins. Our recent work revealed that sites of mucin-type O-glycosylation as they occur in EPO or IgA 1 are particularily affected by Pro-hydroxylation. Plants, e.g. N. benthamiana, contain a multitude of prolyl hydroxylase homologs (paralogs). Based on research with Arabidopsis thaliana and the moss Physcomitrella patens only one or a few of them may be responsible for modification of a particular protein. Our aim is to identify the responsible hydroxylase(s) for several different substrate proteins (EPO, IgA1, weed pollen allergen Art v 1) by affinity enrichment and mass spectrometry. Identified sequences shall then be recombinantly expressed to verify their activity for the different substrates. Most importantly, they shall be used to generate knock-down N. benthamiana plants. “Reporter proteins” shall be expressed in the knock-down line(s) and shall be analyzed by mass spectrometry for alterations in the degree of prolyl hydroxylation.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2016-12-01 - 2019-11-30

Struktur und Funktion von Hexosaminidasen aus Invertebraten Hexosaminidasen sind ubiquitäre Enzyme mit einem Vielfalt von Aufgaben im Glykokonjugatmetabolismus, da sie terminale N-acetylhexosamin-Reste von Glykanen, Glykolipiden, Glykoproteinen und Glykosaminoglykanen abspalten. Während diese Enzyme in Säugetieren nur am Abbau beteiligt sind, prozessieren sie in anderen Spezien die Reifung proteingebundener Zuckerketten (analog zu Mannosidasen im endoplasmatischen Reticulum und Golgi-Apparat). Trotzdem ist unser Wissen über die biologische Relevanz und die strukturelle Grundlage Hexosaminidase-vermittelter Glykanreifung in wirbellosen Tieren gering. Im Rahmen dieses Projekts soll die Substratspezifität dieser Enzyme aus Fadenwürmern (Nematoden) und Insekten insbesonders durch die Analyse der beteiligten Aminosäureresten, die für die Substratbindung und Katalyse verantwortlich sind sowie die Auswirkungen von Gen-Ausschaltung auf Streß- und Infektionsreaktionen untersucht werden. Es wird vermutet, daß durch konvergente Evolution die phylogenetisch-weitentfernten Hexosaminidasen der Insekten und Nematoden, die gleiche Funktion in der Glykanreifung übernommen haben.

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